哺乳动物细胞表达与纯化

哺乳动物细胞表达与纯化服务

服务描述:

哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主。其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号,识别和去除基因中的内含子,再经剪切加工成为成熟的mRNA,能准确地完成糖基化、磷酸化,形成链内和链间二硫键及蛋白水解等翻译后加工过程,因而产生的完整重组蛋白和天然蛋白一样,具有生物学活性,既可识别抗原又可激活补体系统。哺乳动物细胞易被重组的DNA转染,经过筛选可得到转化的细胞,具有遗传稳定性和可重复性,表达的产物分泌到培养基中易于纯化等优势。因此,利用哺乳动物细胞表达外源蛋白已经广泛应于生物医药的多个领域。我们公司可根据您的样品特点选择在不同的哺乳动物细胞中进行表达,为您提供与天然蛋白结构完全相同的重组蛋白。

众红优势:

应用特有表达载体及采用优化后的电转染方法,实验周期缩短,表达量显著提高。

可提供瞬时转染实验图片及纯化产物和稳定转染的细胞株。

表达条件优化,瞬时转染效率高达80%~90%;细胞稳定转染的筛选时间为1~2个月。

具备细胞大规模放大培养的能力,可提供克级别哺乳动物细胞表达蛋白。

具体内容:

服务步骤

主要内容

交付内容

交付时间

目的基因全基因合成

1.客户提供或从GenBank中寻找目的蛋白cDNA序列。
2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子及mRNA二级结构的优化。
3.合成设计好的基因序列。

目的基因(连接在T载体或其它常规克隆载体上)及测序报告。

3-4周

 

目的基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体

1.培养并提取含有目的基因的表达载体。
2.将目的基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体上。
3.测序验证构建质粒的准确性。
4.通过中抽获得重组质粒DNA。

正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的Top10菌株及测序报告。

2周

小量转染并通过Western-blot检测表达

1.利用转染试剂或电转染将重组质粒转入合适的哺乳动物细胞中。
2.从转染后24h到72h,每12h取样一次,通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白表达情况。

目的蛋白表达结果

2周

目的蛋白瞬时表达及纯化

1.培养500ml哺乳动物细胞,然后将重组质粒转染到细胞中,通过瞬时表达产生目的蛋白。
2.收集含有目的蛋白的部分(细胞或培养上清)。
3.通过亲和,离子,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
4.通过SDS-PAGE电泳检测每步纯化结果并控制最终产品质量。
5.通过Western-blot验证目的蛋白正确性。

纯化好的目的蛋白及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度可达80%以上。

3-4周

目的蛋白的再加工及详细检测

1.内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。
2.通过HPLC等方法详细检测目的蛋白的质量。通过亲和,离子,疏水及凝胶过滤等多种 层析方法纯化表达的重组蛋白。

加工后的终产品及相关实验和检测报告。

2-3周

目的蛋白稳定高表达细胞株加压筛选

1.将转染后的哺乳动物细胞团转到96孔细胞培养板内,然后加入含有MTX的培养基。
2.当细胞长到大约2/3孔时,取培养上清检测表达。
3.挑出高表达的细胞团用于下一轮筛选,并在下一次细胞培养基中提高MTX的浓度。
4.重复加压筛选过程,提高细胞株的表达量直到获得合适的稳定表达株。
5.通过SDS-PAGE电泳检测每步表达结果。
6.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

稳定的高表达细胞株及筛选报告

6-8周

大规模制备

按照小试工艺放大生产规模,2-20L细胞高密度发酵,制备客户需要的合格蛋白产品。

合格的目的蛋白及服务报告。

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