哺乳动物细胞表达与纯化

服务步骤

主要内容

交付内容

交付时间

目的基因全基因合成

1.客户提供或从GenBank中寻找目的蛋白cDNA序列。
2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子及mRNA二级结构的优化。
3.合成设计好的基因序列。

目的基因（连接在T载体或其它常规克隆载体上）及测序报告。

3-4周

目的基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体

1.培养并提取含有目的基因的表达载体。
2.将目的基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体上。
3.测序验证构建质粒的准确性。
4.通过中抽获得重组质粒DNA。

正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的Top10菌株及测序报告。

2周

小量转染并通过Western-blot检测表达

1.利用转染试剂或电转染将重组质粒转入合适的哺乳动物细胞中。
2.从转染后24h到72h，每12h取样一次，通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白表达情况。

目的蛋白表达结果

2周

目的蛋白瞬时表达及纯化

1.培养500ml哺乳动物细胞，然后将重组质粒转染到细胞中，通过瞬时表达产生目的蛋白。
2.收集含有目的蛋白的部分（细胞或培养上清）。
3.通过亲和，离子，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
4.通过SDS-PAGE电泳检测每步纯化结果并控制最终产品质量。
5.通过Western-blot验证目的蛋白正确性。

纯化好的目的蛋白及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度可达80%以上。

3-4周

目的蛋白的再加工及详细检测

1.内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
2.通过HPLC等方法详细检测目的蛋白的质量。通过亲和，离子，疏水及凝胶过滤等多种 层析方法纯化表达的重组蛋白。

加工后的终产品及相关实验和检测报告。

2-3周

目的蛋白稳定高表达细胞株加压筛选

1.将转染后的哺乳动物细胞团转到96孔细胞培养板内，然后加入含有MTX的培养基。
2.当细胞长到大约2/3孔时，取培养上清检测表达。
3.挑出高表达的细胞团用于下一轮筛选，并在下一次细胞培养基中提高MTX的浓度。
4.重复加压筛选过程，提高细胞株的表达量直到获得合适的稳定表达株。
5.通过SDS-PAGE电泳检测每步表达结果。
6.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

稳定的高表达细胞株及筛选报告

6-8周

大规模制备

按照小试工艺放大生产规模，2-20L细胞高密度发酵，制备客户需要的合格蛋白产品。

合格的目的蛋白及服务报告。

询问