毕赤酵母表达与纯化

服务步骤

主要内容

交付内容

交付时间

目的基因全基因合成

1. 从GenBank中寻找目的蛋白的cDNA序列。
2. 根据选用的表达系统对cDNA进行密码子及mRNA二级结构的优化。
3. 合成设计好的基因序列。

目的基因（连接在T载体或其它常规克隆载体上）及测序报告。

3-4周

目的基因亚克隆

1. 培养并提取含有目的基因的表达载体。
2. 将目的基因亚克隆到合适的表达载体上。
3. 测序验证构建表达载体的准确性。
4. 可提供表达载体（pPICZα为主）。

正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。

2-3周

毕赤酵母表达菌株电转化

1. 酶切线性化表达载体。
2. 将表达载体通过电转化到高效的毕赤酵母表达菌株中。
3. 通过PCR或者表达产物鉴定挑选至少5个阳性克隆。
4.可提供不同表型的表达菌株。

PCR阳性克隆及PCR结果报告

2周

毕赤酵母表达菌株筛选

1. 将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增，然后更换至BMMY培养基中，并加入甲醇诱导表达目的蛋白。
2. SDS-PAGE电泳检测培养上清中目的蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目的蛋白的表达
3. 如果培养上清中检测不到表达，则通过将上清浓缩20倍作用再检测，或通过Western-blot方法检测目的蛋白表达（客户需要提供相关抗体）。

阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。

2周

毕赤酵母表达菌株表达优化

1. 挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达最好菌株优化表达条件。
2. 对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件（培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等），提高目的蛋白的表达量。

三个阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。

2周

目的蛋白表达及纯化

1. 摇瓶培养1L重组酵母菌，诱导表达目的蛋白。.
2. 通过亲和，离子，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
3. 通过SDS-PAGE电泳检测每步纯化结果并控制最终产品质量。
4. 通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

纯化好的目的蛋白1~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度可达80%以上。

2-3周

目的蛋白的再加工及详细检测

1. 内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
2. 通过HPLC等方法详细检测目的蛋白的质量。

加工后的终产品及相关实验和检测报告

2周

大规模制备

按照小试工艺放大生产规模，5L~30L高密度发酵并制备客户需要的合格蛋白产品。

合格的目的蛋白及服务报告

协商