毕赤酵母表达与纯化

毕赤酵母表达与纯化服务

服务描述:

毕赤酵母蛋白表达系统是一种最经济高效的真核蛋白表达系统,可以成功实现胞内表达或是分泌表达,且其放大培养基相对廉价,培养条件要求不高,适宜工业放大。与哺乳动物细胞表达系统一样,毕赤酵母蛋白表达系统能够对所表达蛋白进行例如糖基化、酰基化、脂基化、磷酸基化等修饰保证蛋白天然构象的修饰,可用于制备非常接近天然蛋白的具有高附加值的蛋白原料。
   
我们的毕赤酵母蛋白表达平台由多年从事酵母表达操作的实验人员组成,经验丰富,采用自行改造的高效分泌载体和宿主组合,可在最大程度上实现最高质量的蛋白表达。经客户反馈,以我平台所制备的蛋白原料为抗原所制备的单抗均具有很好的识别天然蛋白的优良特性。

众红优势:

采用自行改造的高效分泌载体:pPIC9KpPIC3.5K,高效融合载体pPICZαpGAPZα与宿主GS115KM71X33的正交组合。PINK系统优化分泌表达信号肽。胞内表达采用自行改造的载体pPIC 3.5K载体和宿主GS115KM71X33的组合,可在最大程度上实现表达。

高效的种子筛选工作能使您所定制的蛋白在最短的时间内获得尽可能高的产量。

具体内容:

服务步骤

主要内容

交付内容

交付时间

目的基因全基因合成

1. 从GenBank中寻找目的蛋白的cDNA序列。
2. 根据选用的表达系统对cDNA进行密码子及mRNA二级结构的优化。
3. 合成设计好的基因序列。

目的基因(连接在T载体或其它常规克隆载体上)及测序报告。

3-4周

目的基因亚克隆

1. 培养并提取含有目的基因的表达载体。
2. 将目的基因亚克隆到合适的表达载体上。
3. 测序验证构建表达载体的准确性。
4. 可提供表达载体(pPICZα为主)。

正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。

2-3周

毕赤酵母表达菌株电转化

1. 酶切线性化表达载体。
2. 将表达载体通过电转化到高效的毕赤酵母表达菌株中。
3. 通过PCR或者表达产物鉴定挑选至少5个阳性克隆。
4.可提供不同表型的表达菌株。

PCR阳性克隆及PCR结果报告

2周

毕赤酵母表达菌株筛选

1. 将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增,然后更换至BMMY培养基中,并加入甲醇诱导表达目的蛋白。
2. SDS-PAGE电泳检测培养上清中目的蛋白的表达情况,并挑选合适的单克隆菌株用于目的蛋白的表达
3. 如果培养上清中检测不到表达,则通过将上清浓缩20倍作用再检测,或通过Western-blot方法检测目的蛋白表达(客户需要提供相关抗体)。

阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。

2

毕赤酵母表达菌株表达优化

1. 挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选,并对其中表达最好菌株优化表达条件。
2. 对挑选出来的单克隆菌株,优化培养及诱导条件(培养基,菌体密度,甲醇浓度,诱导时间等),提高目的蛋白的表达量。

三个阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。

2周

目的蛋白表达及纯化

1. 摇瓶培养1L重组酵母菌,诱导表达目的蛋白。.
2. 通过亲和,离子,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
3. 通过SDS-PAGE电泳检测每步纯化结果并控制最终产品质量。
4. 通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

纯化好的目的蛋白1~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度可达80%以上。

2-3周

目的蛋白的再加工及详细检测

1. 内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。
2. 通过HPLC等方法详细检测目的蛋白的质量。

加工后的终产品及相关实验和检测报告

2周

大规模制备

按照小试工艺放大生产规模,5L~30L高密度发酵并制备客户需要的合格蛋白产品。

合格的目的蛋白及服务报告

协商